Главная » Справочники » Магистратура Анохин »

Современные методы исследований мозга

Преподаватели: сотрудники Института перспективных исследований мозга Ивашкина О.И. и Торопова К.А.

 

Тема 1. Оптические методы регистрации клеточной активности мозга животных в нейробиологии.

Основные концепции оптической регистрации клеточной активности. Принципы работы кальциевых индикаторов. Применение GCaMP и аналогов для визуализации. Двухфотонная микроскопия. Преимущества для исследования глубинных слоев мозга. Оптогенетические методы в сочетании с кальциевой визуализацией.  Мультифотонные методы для наблюдения в реальном времени. Минимикроскопия. Подготовка животных, экспрессия индикаторов, хирургические вмешательства.

Тема 2. Хирургические основы метода минимикроскопии для регистрации нейронной активности у лабораторных мышей.

Применение минископов для регистрации нейронной активности, основные принципы метода. Подготовка животных к хирургическому вмешательству, анестезия и обезболивание. Подготовка операционного поля. Хирургическая имплантация линзы и установка держателя для минископа. Инъекция вирусных векторов для экспрессии кальциевых индикаторов. Технические ошибки и возможные осложнения при хирургической установке, методы их предотвращения. Постоперационный уход за животными. Подключение и тестирование оборудования после операции. Калибровка и настройка минископа для экспериментов.

 Тема 3. Методические основы регистрации нейронной активности мозга методом минимикроскопии во время свободного поведения животных в открытом поле.

Применение теста в открытом поле для оценки поведения и нейронной активности. Параметры поведения, регистрируемые в тесте (горизонтальная и вертикальная активность, тревожность). Подготовка животных к эксперименту, хэндлинг. Процедура установки минископа. Настройка минископа для работы в условиях свободного поведения животного. Регистрация данных нейронной активности с помощью минископов в реальном времени. Синхронизация данных нейронной активности с поведенческими параметрами. Корреляция между поведением и нейронными сигналами. Настройка оборудования для минимизации артефактов движения. Построение протоколов для длительных регистраций без стресса для животных.

Тема 4. Методические основы регистрации нейронной активности мозга лабораторных животных методом минимикроскопии в тесте на распознавание знакомых объектов.

Цели и задачи теста на распознавание объектов. Когнитивные процессы, оцениваемые в тесте (память, внимание). Роль теста в нейробиологических исследованиях. Подготовка животных к эксперименту, крепление минископа. Введение вирусных векторов для экспрессии кальциевых индикаторов. Процедура проведения теста на распознавание объектов. Экспериментальные этапы: знакомство и исследование. Оборудование для регистрации поведения. Регистрация нейронной активности во время теста. Настройка минископа для регистрации активности в реальном времени. Техника синхронизации нейронных сигналов с моментами взаимодействия с объектами. Интерпретация результатов эксперимента.

 Тема 5. Методические основы осуществления морфологического контроля очага заражения вирусным вектором в мозге животного для целей минимикроскопической регистрации нейронной активности мозга. Методика проведения интракардиальной перфузии на лабораторной мыши.

Процедура заражения вирусным вектором и контроля его распространения. Морфологические маркеры заражения. Интракардиальная перфузия: цели и значение для гистологического анализа. Протокол перфузии для сохранения тканей мозга. Методика интракардиальной перфузии на мышах. Техника введения буферов и фиксаторов через сердечно-сосудистую систему. Морфологический контроль заражения вирусным вектором для визуализации заражённых клеток. Подготовка и консервация тканей мозга для дальнейшего анализа.

Тема 6. Методические основы осуществления морфологического контроля очага заражения вирусным вектором в мозге животного для целей минимикроскопической регистрации нейронной активности мозга. Методика получения срезов мозга лабораторной мыши при помощи микротома с вибрирующим лезвием.

Подготовка мозга для микротомии. Принципы работы с вибрирующим лезвием. Получение срезов мозга для гистологического анализа. Расположение срезов мозга мыши на предметном стекле и покрытие образцов покровными стеклами.

 Тема 7. Современные методы микроскопии и их применение в нейробиологических исследованиях. Принципы флуоресцентной микроскопии и техника получения изображений на флуоресцентном микроскопе.

Оптическая, электронная и мультифотонная микроскопия. Принципы флуоресцентной микроскопии. Типы флуоресцентных микроскопов: конфокальная, широкопольная, двухфотонная. Преимущества и ограничения флуоресцентной микроскопии. Глубина проникновения, разрешение и артефакты. Техника получения изображений на флуоресцентном микроскопе. Настройка оборудования, выбор длины волны. Программное обеспечение для обработки и анализа флуоресцентных изображений.

 Тема 8. Методы обработки и анализа нейронной активности мозга лабораторных животных с использованием кальциевой визуализации.

Принципы регистрации нейронной активности через кальциевые индикаторы. Процесс получения сигналов нейронной активности. Фильтрация шума и артефактов. Алгоритмы деконволюции сигналов. Выделение нейронных вспышек активности. Анализ пространственно-временных паттернов. Определение активных нейронов и кластеризация. Корреляция между нейронными сигналами и поведением. Программные средства для анализа и представления результатов.

 Тема 9. Методы обработки и анализа данных о кальциевой активности нейронов мозга мышей, полученных посредством минимикроскопии на лабораторной мыши.

Принципы работы и регистрация кальциевой активности при помощи минимикроскопов. Предварительная обработка данных: коррекция смещений и артефактов движения. Алгоритмы деконволюции кальциевых сигналов. Выделение нейронных вспышек активности. Анализ пространственно-временных паттернов: кластеризация и временная корреляция нейронной активности. Способы визуализации результатов: карты активности и динамика сетей. Интерпретация нейронной активности и сопоставление с поведенческими параметрами.

 Тема 10. Анализ поведения лабораторных мышей в нейробиологических экспериментах: от наблюдений к количественным данным.

Основы поведенческого анализа. Ключевые параметры поведения в нейробиологических экспериментах. Методы наблюдения и регистрации поведения. Использование видеонаблюдения, сенсоров и других инструментов для фиксации поведения. Автоматизированные системы анализа поведения. Программное обеспечение для анализа и категоризации действий. Квантификация данных. Преобразование наблюдений в количественные показатели.

 Тема 11. Статистическая обработка данных в нейробиологических экспериментах.

Основные статистические концепции и их применение в нейробиологических исследованиях. Критерии выбора методов анализа данных: параметрические и непараметрические тесты. Тесты значимости: t-тесты, ANOVA, критерий Манна-Уитни, критерий Краскела-Уоллиса. Корреляционный анализ взаимосвязей между переменными, корреляции Пирсона и Спирмена. Линейная и нелинейная регрессия для предсказания результатов. Ошибки и коррекция множественных сравнений методом Шидака и методом Тьюки. Контроль за ошибками I и II типа.

 Тема 12. Современный подход к представлению результатов нейробиологического эксперимента на лабораторных животных.

Интерпретация и визуализация статистических результатов. Стандарты в оформлении научных результатов. Выбор и создание графиков (бар-чарты, линейные графики, тепловые карты). Основы работы с программами для визуализации данных. Структурирование данных в таблицах для научных публикаций. Представление статистических значений и ошибок. Подготовка изображений для научных публикаций.